賀永教授團隊：高精度3D打印仿生ECM助力微納結構對細胞行為調控機制的探究

來源：浙江大學機械工程學院

從物質層面看器官的核心組分是細胞及貫穿于其中的微納結構（通常稱之為ECM，細胞外基質）。ECM是一個尺度在數個微米到幾百納米的復雜三維網絡，作為骨架與細胞協(xié)同，行使并發(fā)揮出器官的功能。一個重要的科學問題就是微納結構如何對細胞施加影響？然而天然的ECM結構微納特征異常復雜，除了微納結構外還耦合生化信號，導致目前相關研究受生化信號干擾較大，易出現彼此矛盾的研究結果，不利于量化探究微納結構對細胞的調控機制。

為此，EFL團隊提出使用高精度3D打印手段在體外精確重建具有異質拓撲結構的工程化ECM，從而消除復雜生化信號對研究的干擾。利用構建的工程化ECM可以量化ECM-細胞相互作用的規(guī)律，推動ECM-細胞相互作用的研究。

相關研究成果以“Morphology Guided Cellular Behavior Modulation with 3D Printed Engineered ECM”為題，發(fā)表于Cell子刊《Cell Biomaterials》上。浙江大學機械工程學院賀永教授、孫元博士后為該論文共同通訊作者，劉念博士、史洋博士為該論文共同第一作者。

研究內容
該研究主要從三個視角來闡明異質ECM與細胞的相互作用：①細胞更喜愛哪種形貌的ECM？②ECM中的哪種差異因素驅動了細胞的選擇偏好？③細胞如何感知ECM的形貌差異？

解決這三個問題將加深我們對各種ECM環(huán)境中細胞偏好的理解。所獲得的見解不僅將推進我們對細胞行為的基本理解，而且還將為仿生ECM的設計和制造提供重要指導。這些進步對于開發(fā)更準確地模仿自然組織復雜性的人工組織和器官至關重要，最終有助于提升組織工程與再生醫(yī)學的成果產出。

1.細胞更喜愛哪種形貌的ECM？——細胞更偏愛更粗的ECM
利用EFL-BP66013D打印機制造了直徑分別為20 μm和5 μm的正交纖維網格支架，纖維間距為100 μm，將該區(qū)域劃分為離散的方形區(qū)域。這個間距明顯大于單個細胞的大小，可以清楚地觀察到細胞對ECM的識別過程。異質ECM中的每個細胞都類似于小房間中的人，在這種情況下觀察細胞行為可以深入了解細胞對特定ECM特征的偏好。

利用EFL-CV1000活細胞動態(tài)觀察儀實時原位連續(xù)監(jiān)測細胞行為。觀測結果表明在播種后3小時內，細胞對周圍的ECM進行識別和評估，絕大多數細胞逐漸向更粗的ECM遷移和積累。到第4小時，細胞停止遷移并開始粘附在偏愛的支架上。在這一階段之后，粘附在支架上的細胞開始增殖，直到實現融合。

2.ECM誘導特定細胞行為——細胞沿著偏愛的ECM定向排列
異質ECM中的細胞呈現各向異性排列，其方向與粗支架的方向一致。異質ECM內的細胞在播種后3小時內識別了不同的ECM，向粗纖維遷移并積累，最終粘附在粗纖維上。粘附在粗支架上的細胞自發(fā)地沿著支架軸線方向延伸。隨后，貼壁細胞開始增殖，新細胞在原有細胞取向的基礎上依舊沿支架軸線方向延伸，導致所有細胞定向排列并與粗支架的方向一致。

3.ECM中的哪種差異因素驅動了細胞的選擇偏好？——ECM的曲率差異，而非黏附位點差異，決定了細胞的選擇偏好

研究表明粘附位點密度的變化不是選擇性遷移的原因。值得注意的是，無論ECM表面成分如何，細胞都保持對粗支架的偏好，這表明細胞對ECM的偏好是由材料成分以外的因素驅動。然而，細胞在相同曲率的ECM支架內呈現各向同性排列，證實支架曲率差異確實是選擇性遷移背后的驅動因素。

4.ECM中的哪種差異因素驅動了細胞的選擇偏好？——細胞感知ECM的相對曲率差異

異質ECM中的細胞表現出對ECM相對曲率的識別和響應能力，表明細胞對曲率變化具有高度敏感性。單個細胞類似于水滴，支架上細胞的形狀由Young-Laplace方程決定。位于低曲率半徑（高曲率）支架上的細胞承受更大的壓差，導致內應力增加。此外，當細胞的短軸與纖維方向一致時，細胞會受到拉伸，從而減少其厚度并產生顯著的壓力差，特別是在細胞的邊緣。在液體體積守恒的約束下，細胞的勢能需維持最小化，導致細胞傾向于將其長軸定向到與纖維延伸一致的方向。

可以形象地描述為：細胞不喜歡使自身產生向內的卷曲形變，而更傾向于“沒有壓力地”舒展在平躺的環(huán)境中。和人相似，細胞也拒絕“被迫地內卷”，喜歡“無壓力地躺平”。

5.細胞如何感知ECM的形貌差異？——細胞通過絲狀偽足感知ECM的相對曲率差異

片狀偽足（板足），作為細胞的“手掌”，是細胞遷移的主要驅動力。不能形成板足的細胞，其實現大范圍運動的能力受損，導致各向同性排列。絲狀偽足，作為細胞的“手指”，是感知ECM的特殊結構。如果沒有足夠的絲狀足形成，細胞就會失去檢測支架曲率差異的能力，從而導致沿X軸和Y軸的隨機遷移和排列。

6.異質ECM與細胞的相互作用——ECM通過細胞內應力直接調節(jié)細胞形態(tài)
在均質ECM中，細胞內應力是全方位的，導致細胞內應力相互抵消形成“力平衡”狀態(tài)。然而，在異質ECM中，這些內應力是定向的；極化的應力在整個系統(tǒng)中積累，每個細胞都受到拉伸內應力，導致細胞形態(tài)和空間排列的變化。

7.異質ECM與細胞的相互作用——ECM間接調節(jié)細胞功能和命運
ECM可以通過直接調節(jié)細胞內機械應力來調節(jié)細胞形態(tài)，甚至細胞核形態(tài)，從而間接影響細胞的生理生化狀態(tài)，如基因表達、信號轉導和蛋白質合成。

總結與討論
總之，各向異性ECM提供了細胞可感知的形態(tài)學線索。細胞感知異質ECM內的相對曲率差異，并選擇性地向低曲率區(qū)域遷移以建立定向排列。這種細胞群體的排列導致極化的細胞間相互作用和細胞- ECM粘附。由此產生的極化拉伸力改變了單個細胞及其細胞核的形態(tài)。此外，細胞的這些形態(tài)變化間接影響基因表達和細胞命運，最終導致不同的生物學功能。

在理解細胞行為對ECM形態(tài)的響應方面，各種ECM形態(tài)下的細胞行為可以類比為社會環(huán)境中的人類行為。對人類相互作用的深入了解有助于我們理解細胞對周圍環(huán)境的反應。本研究研究了細胞與ECM之間的相互作用，其尺度與細胞大�。〝凳�微米）相當。在這個尺度上，細胞和ECM之間的關系讓我們聯想起人與一個大物體（如床）之間的關系。正如更大更平坦的床層通常提供更舒適的環(huán)境一樣，低曲率ECM為細胞提供了更有利的環(huán)境，這解釋了它們選擇性地向低曲率ECM遷移，無論細胞或基質類型如何。此外，個體通常沿著矩形床的長軸平躺，而沿著床的短軸躺下會使身體的一部分懸空，引起不適。同樣地，沿著ECM延伸的細胞減少了內應力，這解釋了它們與ECM延伸方向的對齊，這有利于維持正常的細胞形態(tài)。這些相關的類比有助于更深入地了解細胞行為，并支持進一步研究天然ECM中的細胞相互作用。

本研究采用工程方法來解決細胞生物學中的基本問題，在一定程度上填補了細胞- ECM形態(tài)相互作用的認知空白，并總結了一系列與細胞- ECM形態(tài)相互作用相關的特征，這些特征對基礎科學研究和臨床轉化具有重要意義。