3D打印TZGP 復(fù)合支架促進(jìn)糖尿病骨缺損骨血管再生修復(fù)

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糖尿�。―M）可引發(fā)一系列不利的病理微環(huán)境變化，包括骨代謝調(diào)節(jié)因子表達(dá)失調(diào)，脂質(zhì)過(guò)氧化作用和氧化應(yīng)激，破壞骨代謝的穩(wěn)定性，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和骨折的發(fā)生率增加。因此，DM患者的骨缺損和骨折被認(rèn)為是修復(fù)和再生的重要挑戰(zhàn)。

近期，上海工程技術(shù)大學(xué)朱同賀教授團(tuán)隊(duì)、武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授團(tuán)隊(duì)和武漢大學(xué)中南醫(yī)院李景峰教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種用于糖尿病骨缺損修復(fù)的新型TZGP（α-TCP/ZnO/GM@P2）復(fù)合支架（Fig 1）。α-TCP水泥支架、ZnO納米顆粒和負(fù)載P2（一種新型甲狀旁腺激素相關(guān)肽） 的明膠微球（GM）實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)。TZGP支架在滿足松質(zhì)骨的機(jī)械強(qiáng)度要求的同時(shí)，彌補(bǔ)了無(wú)機(jī)支架中生物活性肽的不足。它的生物相容性得到增強(qiáng)，并且支架具有抗菌和抗氧化特性。因此，TZGP支架的新穎設(shè)計(jì)策略為修復(fù)糖尿病骨缺損提供了一種很有前途的方法。

首先，研究人員對(duì)3D打印復(fù)合支架的表征進(jìn)行了檢測(cè)。pH測(cè)定表明ZnONPs的引入略微增加了TZ和TZG支架的pH值，比T支架的pH值更接近中性和生理環(huán)境的pH值（Fig 2H）。同時(shí)Zn2+的釋放動(dòng)力學(xué)表明TZ和TZG支架都可以在前3周內(nèi)穩(wěn)定釋放 Zn2+（Fig 2I）。TZG 支架釋放的Zn2+濃度略高于TZ支架。但是GM的引入使復(fù)合支架機(jī)械性能發(fā)生了下降（Fig 2K）。ZnONPs和Zn2+還可以穿過(guò)受損的膜，破壞內(nèi)部細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)菌死亡（Fig 2L），這將有利于預(yù)防糖尿病骨缺損中的局部細(xì)菌感染。

之后研究人員成功地將P2摻入GM（GP）中（Fig 3A）。Zeta電位測(cè)量表明P2與GM間存在靜電吸引，可以促進(jìn)P2緩慢釋放（Fig 3B）。同時(shí)TZGP支架與GM和T支架相比，表面更粗糙，微孔結(jié)構(gòu)更多，有利于細(xì)胞粘附和增殖（Fig 3E）。活/死細(xì)胞染色和CCK-8結(jié)果證明了所有支架組均具有良好生物相容性，但TZ和TZGP支架更有利于細(xì)胞粘附（Fig 3I-M）。綜上，P2摻入GM形成的TZGP支架具有優(yōu)良的生物相容性和促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

接下來(lái)，研究人員評(píng)估了復(fù)合支架對(duì)BMSCs的功能調(diào)節(jié)作用。根據(jù)EdU結(jié)果，高葡萄糖微環(huán)境降低了BMSCs的增殖和遷移能力，但TZ和TZGP支架能恢復(fù)其增殖活力，尤其是TZGP組（Fig 4A-D）。TZGP支架中的P2作為高活性PTH相關(guān)肽，具有強(qiáng)大的募集BMSCs和促進(jìn)增殖的能力，使其在高葡萄糖環(huán)境中對(duì)BMSCs具有卓越的保護(hù)能力。在成骨分化方面，TZGP組表現(xiàn)出顯著的ALP活性和鈣沉積面積，優(yōu)于TZ組，并更顯著地刺激成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。

高血糖微環(huán)境導(dǎo)致過(guò)量活性氧（ROS）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的積累，這經(jīng)常影響DM患者骨缺損部位的血運(yùn)重建。因此，研究人員對(duì)血管再生也進(jìn)行了研究。EdU染色（Fig 5A、B）和Transwell測(cè)定（Fig 5C、D）顯示High-G組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的增殖和遷移能力嚴(yán)重受損。T 的干預(yù)未能改善這種狀態(tài)。TZGP組顯著減輕了HUVECs的增殖和遷移抑制。成管實(shí)驗(yàn)表明，High-G組僅形成少量血管狀結(jié)構(gòu)，T和TZ組的HUVECs中形成少量間歇性血管，TZGP組形成豐富的連續(xù)血管網(wǎng)絡(luò)（Fig 5E、F）。這表明添加P2賦予了復(fù)合支架高效的血管形成能力。同時(shí)免疫熒光測(cè)定表明，TZGP支架顯著促進(jìn)細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子CD31、HIF-1α和VEGF的表達(dá)（Fig 5I-N）。

隨后研究人員通過(guò)免疫熒光測(cè)定評(píng)估了高葡萄糖環(huán)境中的DNA損傷。結(jié)果顯示，DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX 在High-G組的BMSCs和HUVECs中顯著表達(dá)，而分裂和增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)水平在細(xì)胞核中顯著下調(diào)（Fig 6A-D、I-L）。JC-1熒光探針測(cè)定表明，與High-G組相比，TZ和TZGP組的線粒體膜電位有所提高，尤其是TZGP組，其中BMSC的改善更為顯著（Fig 6E、F、M、N）。此外，使用熒光探針二氫乙錠（DHE）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)（Fig 6G、H、O、P），TZ組BMSCs的ROS產(chǎn)生顯著降低。

在第6周和第12周使用顯微CT和3D重建分析評(píng)估骨修復(fù)。結(jié)果表明DM組的糖尿病骨缺損部位僅在缺損邊緣僅積累了少量骨量。由于缺乏支架支撐，組織遷移到缺損內(nèi)部的速度很慢，因此很難形成新骨。與DM組顯著不同，TZGP組骨缺損定位產(chǎn)生更多的礦化骨組織，支架表面和間隙覆蓋更多的新生骨。同時(shí)，TZGP組的支架降解似乎比T組更明顯，這促進(jìn)了新生骨組織的逐漸再生（Fig 7A，B）。

最后，研究人員通過(guò)病理切片染色評(píng)價(jià)支架的體內(nèi)生物功能。TZGP組中的支架降解最嚴(yán)重，支架周圍和空隙被更多新生組織占據(jù)（Fig 8A、B）。Masson染色結(jié)果與HE結(jié)果一致，在TZGP組中，支架內(nèi)部和周圍散布著更多的紅色和藍(lán)色新骨組織（Fig 8C，D）。此外，RUNX2、Col-I、CD31和HIF-1α的IHC染色反映了成骨和血管生成相關(guān)因子的表達(dá)（Fig 8E）。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種用于糖尿病骨缺損修復(fù)的新型TZGP復(fù)合支架，這種新型TZGP支架的各個(gè)組成部分相輔相成，顯著改善了傳統(tǒng)純?chǔ)?TCP支架降解緩慢、缺乏生物活性肽、存在酸性降解產(chǎn)物等不利因素，為難治性糖尿病骨缺損的修復(fù)提供了一種新的設(shè)計(jì)。

本研究由來(lái)自武漢大學(xué)中南醫(yī)院的李景峰教授團(tuán)隊(duì)完成，并于2025年1月10日發(fā)表于Adv. Funct. Mater。

文獻(xiàn)信息：J. Wang, Y. Xia, Z. Hao, G. Shi, Q. Zhang, C. Wang, M. Zhu, Y. Huang, L. Guo, T. Luan, T. Zhu, H. Dai, J. Li, A Triple-Integrated 3D-Printed Composite Scaffold of High-Activity Peptide-Metal Ion-Bone Cement Facilitates Osteo-Vascular Regenerative Repair of Diabetic Bone Defects. Adv. Funct. Mater. 2025, 2422950.