3D 打印鈦小梁支架緩釋低氧誘導外泌體介導雙重仿生骨再生

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當前臨床上面臨的主要問題是，嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除或感染等導致的大段骨缺損修復困難，傳統(tǒng)治療方式如自體骨移植存在供體不足和并發(fā)癥，異體骨移植有免疫風險，合成材料支架則缺乏骨誘導性和血管化能力，鈦合金（Ti-6Al-4V）植入物雖力學性能優(yōu)異，但存在彈性模量過高（≈110 GPa）導致應(yīng)力屏蔽、表面生物惰性難以促進血管生成等局限。   

來自南方醫(yī)科大學黃文華教授、吳耀彬教授以及胡孔和主任醫(yī)師團隊、暨南大學利時雨副教授團隊合作開展了相關(guān)研究，他們開發(fā)了一種雙重仿生策略，設(shè)計了3D打印仿生小梁多孔鈦合金支架（BTPS），并通過微流控技術(shù)制備了負載低氧誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞來源外泌體（HExo）的PEGDA/GelMA水凝膠微球（PGHExo），利用聚多巴胺（pDA）修飾將微球錨定在支架表面（BTPS&pDA@PGHExo）。該支架通過Voronoi算法模擬天然骨小梁的幾何結(jié)構(gòu)與力學性能（彈性模量≈3.2 GPa，滲透率11.52×10⁻⁸ mm²），結(jié)合HExo的持續(xù)釋放（體外釋放≥30天），協(xié)同促進成骨分化和血管生成。   

相關(guān)工作以“3D-Printed Titanium Trabecular Scaffolds with Sustained Release of Hypoxia-Induced Exosomes for Dual-Mimetic Bone Regeneration”為題發(fā)表在《Advanced Science》上。

圖1. BTPS&pDA@PGHExo支架用于大段骨缺損修復的制備流程及治療機制示意圖。

1. 仿生小梁鈦支架的設(shè)計與制備，通過Voronoi算法結(jié)合股骨松質(zhì)骨CT數(shù)據(jù)建模，并利用選擇性激光熔融（SLM）3D打印技術(shù)，制備了孔隙率70%、平均孔徑560 μm的BTPS鈦支架。通過掃描電子顯微鏡（SEM）、能譜分析（EDS）及工業(yè)CT驗證，結(jié)果顯示支架表面光滑、元素分布均勻（Ti/Al/V比例符合Ti-6Al-4V標準），內(nèi)部孔隙連通性良好，力學測試表明其彈性模量為3.2 GPa，接近天然松質(zhì)骨。      

圖2. 仿生小梁鈦支架（BTPS）的結(jié)構(gòu)表征與元素分析。   

2. 支架力學性能與流體動力學分析，采用有限元分析（FEA）模擬支架在500 N壓縮載荷下的應(yīng)力分布，結(jié)果顯示最大應(yīng)力454.26 MPa，無應(yīng)力集中；計算流體動力學（CFD）顯示支架內(nèi)流體流速均勻（無湍流），滲透率為11.52×10⁻⁸ mm²，證實其力學穩(wěn)定性和物質(zhì)傳輸效率。壓縮測試進一步驗證支架屈服載荷達3085.25 N，符合承重需求。      

圖3. 支架力學特性與流體動力學模擬。   

3. 低氧誘導外泌體（HExo）的提取與表征，通過多步超速離心從低氧培養(yǎng)的HUVECs中分離外泌體，利用TEM、納米顆粒跟蹤分析（NTA）及Western blot檢測，結(jié)果顯示HExo呈球形、粒徑約100 nm，低氧條件下VEGFA表達及蛋白濃度顯著高于常氧組，且對HUVECs的促血管形成能力呈劑量依賴性（200 μg/mL時血管網(wǎng)絡(luò)面積最大）。      

圖4. 低氧誘導外泌體的分離、表征與促血管化活性。   

4. PEGDA/GelMA水凝膠微球（PGHExo）的制備與釋放特性，利用微流控芯片技術(shù)制備平均粒徑80 μm的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠微球，通過流變學測試證實其儲能模量（G′）高于單一GelMA凝膠，體外釋放實驗顯示HExo呈持續(xù)釋放模式（18天累計釋放率約80%），熒光追蹤顯示微球在體內(nèi)外均能穩(wěn)定釋放外泌體達4周以上。      

圖5. 外泌體負載水凝膠微球的制備與釋放動力學。   

5. 支架表面改性與體外生物相容性評估，通過聚多巴胺（pDA）涂層將PGHExo錨定至BTPS表面，SEM顯示微球均勻分布，EDS檢測到C/N/O/P元素證實微球成功結(jié)合。活/死細胞染色顯示BTPS&pDA@PGHExo組MC3T3-E1細胞存活率顯著高于對照組，ALP活性及茜素紅礦化結(jié)節(jié)形成量均最優(yōu)，RT-PCR顯示成骨基因（RUNX2/ALP/OCN）和血管生成基因（VEGF/CD31）表達顯著上調(diào)。      

圖6. 支架表面改性與體外成骨/血管化評估。   

6. 支架誘導骨再生的轉(zhuǎn)錄組學機制分析，通過mRNA-seq對比BTPS&pDA@PGHExo與純鈦支架組的基因表達，GO富集分析顯示差異基因顯著富集于“骨骼發(fā)育”“血管生成”“MAPK/mTOR/HIF-1信號通路”，RT-PCR及ELISA驗證ALPL、VEGFB等關(guān)鍵基因和蛋白（RUNX2/VEGF）的上調(diào)，揭示外泌體通過激活多通路協(xié)同促進骨再生。      

圖7. 支架介導骨再生的轉(zhuǎn)錄組學及分子機制驗證。   

7. 兔股骨缺損模型的體內(nèi)修復效果，通過顯微CT（μCT）和組織學染色（亞甲藍-品紅）評估，結(jié)果顯示BTPS&pDA@PGHExo組在12周時新骨體積（28.1 mm³）和骨密度（717.1 mg/cm³）顯著高于對照組，新生血管密度及成熟骨小梁結(jié)構(gòu)形成量最優(yōu)，證實其通過結(jié)構(gòu)仿生與外泌體緩釋的雙重作用實現(xiàn)功能性骨再生。      

圖8. 支架在兔股骨缺損模型中的體內(nèi)修復效能。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種雙重仿生策略，將3D打印鈦小梁支架與低氧誘導外泌體緩釋系統(tǒng)結(jié)合，用于促進血管化骨再生。通過Voronoi算法設(shè)計的仿生小梁結(jié)構(gòu)（孔隙率70%，彈性模量3.2 GPa）有效模擬天然骨的力學性能，聚多巴胺修飾的水凝膠微球?qū)崿F(xiàn)外泌體的持續(xù)釋放（體外≥30天）。體外實驗表明，該支架顯著促進成骨細胞分化（ALP活性提升2.3倍，礦化結(jié)節(jié)面積增加45%）和血管內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)形成（VEGF表達上調(diào)5.8倍）。體內(nèi)兔股骨缺損模型顯示，植入12周后新骨體積達28.1 mm³，骨密度恢復至正常骨的89%，且新生血管密度是單純支架組的3.2倍。轉(zhuǎn)錄組學證實，該體系通過激活MAPK、mTOR和HIF-1信號通路協(xié)同調(diào)控成骨與血管生成。本研究為解決大段骨缺損修復中的力學不匹配和血管化不足提供了新范式，展現(xiàn)出個性化骨再生治療的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

文章來源：
https://advanced.onlinelibrary.w ... 1002/advs.202500599