生物3D打印多成分陣列模擬膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤內(nèi)異質(zhì)性用于藥物評(píng)估

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在生物打印領(lǐng)域，利用微擠出技術(shù)構(gòu)建體外模型時(shí)，小體積水凝膠墨水易因擴(kuò)散和蒸發(fā)導(dǎo)致打印分辨率下降、細(xì)胞活性降低，且難以在單一系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高通量數(shù)據(jù)產(chǎn)出，限制了對(duì)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性等復(fù)雜生物場景的模擬。來自韓國科學(xué)技術(shù)院（KAIST）的Je-Kyun Park教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于多生物墨水打印和氣溶膠交聯(lián)技術(shù)的微擠出生物打印方法，通過在打印過程中引入氯化鈣氣溶膠，有效抑制了納升級(jí)水凝膠微滴的擴(kuò)散和蒸發(fā)，使打印穩(wěn)定性和產(chǎn)量提升至99%以上。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用多槍管噴嘴構(gòu)建了包含100種不同細(xì)胞組成的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）多成分陣列，復(fù)現(xiàn)了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性微環(huán)境，并成功應(yīng)用于替莫唑胺（TMZ）的藥效評(píng)估。實(shí)驗(yàn)表明，該陣列可同步分析不同細(xì)胞組成對(duì)藥物的響應(yīng)差異，為腫瘤藥物篩選提供了高通量平臺(tái)。相關(guān)工作以“Bioprinting of a multi-composition array to mimic intra-tumor heterogeneity of glioblastoma for drug evaluation”為題發(fā)表在《Microsystems & Nanoengineering》上。

1. 基于氣溶膠交聯(lián)的穩(wěn)定微擠出打印技術(shù)原理，通過在微擠出打印過程中引入10%氯化鈣（CaCl₂）氣溶膠，研究了納升級(jí)水凝膠微滴在空氣暴露下的擴(kuò)散和蒸發(fā)問題。結(jié)果表明，氣溶膠通過實(shí)時(shí)凝膠化和維持濕潤環(huán)境，使250納升藻酸鹽微滴在400秒內(nèi)體積保持率從對(duì)照組的0%提升至97%，接觸角從0°增加至60°，顯著改善了打印分辨率和穩(wěn)定性，且10×10陣列的附著率從對(duì)照組的20%提升至97%。      

圖1. 利用交聯(lián)氣溶膠穩(wěn)定微擠出打印小體積水凝膠陣列的示意圖及效果。   

2. 納升級(jí)水凝膠微滴陣列的規(guī)模化制備，通過優(yōu)化打印速度（100 cm/min）和氣壓（350 mbar），結(jié)合氣溶膠輔助交聯(lián)，研究了10×10至20×30陣列的打印可行性。結(jié)果顯示，600微滴陣列（1.5滴/秒）的生產(chǎn)效率達(dá)99.83%，且微滴體積均勻性提升，解決了傳統(tǒng)方法中長時(shí)間打印導(dǎo)致的蒸發(fā)和附著不穩(wěn)定問題。      

圖2. 小體積大規(guī)模水凝膠陣列的穩(wěn)定打印技術(shù)驗(yàn)證。   

3. 多成分異質(zhì)圖案陣列的打印與表征，通過多槍管噴嘴結(jié)合氣溶膠交聯(lián)，研究了三材料切換（紅/綠/藍(lán)熒光珠）和雙材料梯度混合（紅+綠熒光珠）的打印能力。結(jié)果表明，陣列中熒光珠比例與氣壓調(diào)控的材料擠出比例高度吻合（R²>0.95），成功制備了條帶化和梯度化的多成分陣列，驗(yàn)證了多材料精準(zhǔn)控制的可行性。      

圖3. 使用多槍管噴嘴和氣溶膠打印多成分水凝膠陣列的圖案與機(jī)制。   

4. 生物打印膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）陣列的生物相容性評(píng)估，通過活/死染色和細(xì)胞 viability 檢測，研究了含U87MG（TMZ敏感）和T98G（TMZ耐藥）細(xì)胞的單成分陣列在氣溶膠輔助打印后的性能。結(jié)果顯示，氣溶膠組細(xì)胞存活率在7天內(nèi)維持>90%，顯著高于對(duì)照組（<50%），且陣列附著穩(wěn)定，證明了該技術(shù)在細(xì)胞封裝中的適用性。      

圖4. 生物打印GBM陣列的細(xì)胞活性測試。   

5. 模擬腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的多成分GBM陣列構(gòu)建，通過梯度混合U87MG和T98G細(xì)胞（比例1:99至99:1），結(jié)合熒光標(biāo)記和細(xì)胞形態(tài)分析，研究了100種不同成分陣列的異質(zhì)性模擬能力。結(jié)果表明，陣列中細(xì)胞組成呈線性梯度分布，且隨U87MG比例增加，腫瘤球狀體直徑從50 μm增至300 μm，驗(yàn)證了微環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長的調(diào)控作用。      

圖5. 生物打印多成分GBM陣列模擬腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。   

6. 替莫唑胺（TMZ）在異質(zhì)GBM陣列中的藥效評(píng)估，通過對(duì)790 μM TMZ處理后的陣列進(jìn)行活/死染色和熒光定量，研究了細(xì)胞組成與藥物響應(yīng)的相關(guān)性。結(jié)果表明，U87MG比例高的微滴（51-100號(hào)）存活率<50%，而T98G比例高的微滴（1-50號(hào)）存活率>50%，皮爾遜相關(guān)系數(shù)達(dá)-0.696，證實(shí)了腫瘤異質(zhì)性對(duì)藥物療效的顯著影響。      

圖6. 多成分GBM陣列評(píng)估TMZ藥效的異質(zhì)性響應(yīng)分析。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了基于多生物墨水打印和氣溶膠交聯(lián)的微擠出生物打印技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了納升級(jí)小體積、多成分水凝膠陣列的穩(wěn)定制備。通過引入氯化鈣氣溶膠，有效解決了傳統(tǒng)技術(shù)中 hydrogel 微滴擴(kuò)散和蒸發(fā)導(dǎo)致的打印不穩(wěn)定問題，使陣列生產(chǎn)效率提升至99%以上，并成功構(gòu)建了包含100種細(xì)胞組成的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）多成分陣列，模擬了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性微環(huán)境。體外實(shí)驗(yàn)表明，該陣列支持高細(xì)胞活性（存活率>90%）和動(dòng)態(tài)細(xì)胞互作分析，體內(nèi)藥效評(píng)估顯示其可精準(zhǔn)反映替莫唑胺（TMZ）對(duì)不同細(xì)胞組成的響應(yīng)差異，皮爾遜相關(guān)系數(shù)達(dá)-0.696。本研究為腫瘤藥物高通量篩選提供了新型體外模型，有望推動(dòng)個(gè)性化癌癥治療的發(fā)展。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41378-024-00843-w