基于液滴 3D 低溫生物打印技術構建自立式立體結構

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在組織工程與再生醫(yī)學領域，液滴生物打印技術因具有高分辨率、非接觸式操作等優(yōu)勢而備受關注，但其依賴低黏度生物墨水，導致打印結構缺乏自支撐性，難以構建復雜3D立體結構，且多材料圖案化需繁瑣的層間交聯(lián)步驟，限制了應用場景。來自哈佛醫(yī)學院的Yu Shrike Zhang教授團隊開發(fā)了一種液滴3D低溫生物打印技術，通過將液滴打印與低溫打印結合，利用低溫板（-5至-15℃）使低黏度生物墨水（如7.5% GelMA）在沉積后立即凍結，無需額外支撐即可形成自立式結構，同時避免多材料混合問題。該技術成功打印出金字塔、多層網格及字母“H”“V”等單材料或多材料復雜結構，并實現(xiàn)了C2C12肌成纖維細胞、NIH/3T3成纖維細胞等多種細胞的封裝，細胞存活率在培養(yǎng)2-3周后達80%-90%，還構建了血管化乳腺癌模型驗證多細胞共培養(yǎng)潛力。相關工作以“Droplet 3D cryobioprinting for fabrication of free﹕tanding and volumetric structures”為題發(fā)表在《Aggregate》上。

研究內容
1. 液滴低溫生物打印機示意圖及可實現(xiàn)的結構示例，通過自主搭建的雙微閥低溫打印系統(tǒng)，結合壓力調控（100-300 mbar）與低溫板（-5至-15℃）凍結技術，研究了低黏度生物墨水（7.5% GelMA）的3D打印能力。結果表明，系統(tǒng)可生成1-10 nL穩(wěn)定液滴，通過單/多材料噴射成功構建金字塔、多層網格及字母“H”“V”等自立式結構，驗證了低溫凍結對維持低黏度墨水空間形態(tài)的關鍵作用，避免傳統(tǒng)液滴打印的擴散坍塌問題。   

圖1. 液滴低溫生物打印機示意圖及可實現(xiàn)的結構示例。   

2. 液滴尺寸與打印高寬比量化分析圖，利用光學成像系統(tǒng)（SmartDrop）和流變儀，研究了壓力、閥門開啟時間（500-700 µs）及打印頻率（0.1-20 Hz）對液滴體積和結構高寬比的影響。結果顯示，低壓力（100 mbar）與短開啟時間（500 µs）產生最小液滴（0.8 nL），低溫板溫度越低（如-15℃）、頻率越低（如0.1 Hz），結構高寬比越高（>4），且凍結后水凝膠儲存模量從室溫的0.01 Pa·s躍升至50 Pa·s以上，揭示了低溫通過增強材料彈性維持打印結構穩(wěn)定性的機制。   

圖2. 液滴低溫生物打印的打印性能。   

3. 細胞封裝存活率與形態(tài)演變圖，通過活/死染色（Calcein-AM/PI）和免疫熒光染色（F-actin/DAPI），研究了C2C12肌細胞、NIH/3T3成纖維細胞在-5℃/-10℃打印后的存活與增殖行為。結果表明，初始存活率約50%，培養(yǎng)14天后升至80%-90%，細胞呈擴散生長并形成互連網絡；星形膠質細胞在3%低濃度GelMA中鋪展面積更大（14天達初始3倍），但結構穩(wěn)定性隨濃度降低而下降，提示需平衡細胞活性與力學性能。   

圖3. 液滴低溫生物打印C2C12和NIH/3T3細胞。   

4. 不同GelMA濃度下星形膠質細胞打印表征圖，通過對比3%與7.5% GelMA濃度，研究了水凝膠剛度對星形膠質細胞行為的影響。結果顯示，3% GelMA組第7天存活率（80%）顯著高于7.5%組（60%），細胞覆蓋面積在14天達到7.5%組的2.3倍，但低濃度水凝膠在培養(yǎng)后期出現(xiàn)輕微結構坍塌，表明軟基質促進細胞鋪展但需優(yōu)化長期穩(wěn)定性。   

圖4. 不同GelMA濃度的液滴低溫生物打印及細胞行為分析。   

5. 多材料空間異質性結構打印圖，利用雙微閥系統(tǒng)加載熒光染料標記的GelMA，研究了多材料分層打印的可行性。結果表明，低溫凍結可防止不同材料混合，成功打印交替層狀網格結構，界面清晰無擴散；進一步構建MCF-7腫瘤細胞與HUVEC血管內皮細胞的共培養(yǎng)模型，證明兩種細胞在21天內保持空間分隔并正常增殖，驗證了模擬復雜組織微環(huán)境的能力。   

圖5. 液滴低溫生物打印的多材料結構。   

6. 血管化乳腺癌模型共培養(yǎng)表征圖，通過分層打印兩層MCF-7細胞（2.5×10⁶ cells/mL）與兩層GFP標記HUVECs（5×10⁶ cells/mL），研究了多細胞類型的空間分布與相互作用。結果顯示，HUVECs在腫瘤細胞層上方形成血管樣結構，培養(yǎng)21天后交界處可見內皮細胞向腫瘤細胞方向萌芽，兩組細胞存活率分別達90%和80%，證實該技術在構建血管化腫瘤模型中的應用潛力。   

圖6. 液滴低溫生物打印構建的血管化乳腺癌模型。

研究結論
本研究開發(fā)了液滴3D低溫生物打印技術，融合液滴打印與低溫凍結，解決了傳統(tǒng)液滴打印難以構建復雜3D自立結構的難題。系統(tǒng)可生成1-10 nL液滴，通過-5至-15℃低溫板實現(xiàn)低黏度水凝膠（如7.5% GelMA）的快速固化，成功打印單/多材料立體結構（如金字塔、血管化腫瘤模型），結構高寬比最高達4以上。細胞封裝實驗表明，C2C12、NIH/3T3等細胞在打印后培養(yǎng)14天存活率達80%-90%，星形膠質細胞在3%低濃度水凝膠中鋪展更佳。多材料打印證實該技術可精準控制細胞空間分布，構建的血管化乳腺癌模型中腫瘤細胞與內皮細胞保持功能活性。本研究為復雜組織工程結構和多細胞共培養(yǎng)模型的構建提供了新方法，但其在大尺寸結構打印和細胞長期活性調控方面仍需優(yōu)化。
文章來源：
https://doi.org/10.1002/agt2.599