GUT|清華機(jī)械系生物制造中心團(tuán)隊(duì)龐媛副研究員、孫偉教授課題組合作發(fā)表“生物3D打...

三維(3D)生物打印是用于構(gòu)建肝組織模型、治療肝衰竭的一項(xiàng)前景廣闊的技術(shù)。然而，目前肝組織模型生物打印研究主要依賴傳統(tǒng)的基于單細(xì)胞的生物打印方式，在此過程中，單個(gè)功能性肝細(xì)胞分散且孤立于水凝膠中，由于細(xì)胞功能不足導(dǎo)致治療效果不理想。清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心團(tuán)隊(duì)龐媛副研究員、孫偉教授課題組與北京大學(xué)鄧宏魁教授團(tuán)隊(duì)合作，采用基于球體的生物打印來構(gòu)建肝組織模型(3DP-HOs)，并在體外和體內(nèi)評估其肝臟特異性功能。該文章名為“Bioprintingfunctional hepatocyte organoids derived from human chemically inducedpluripotent stem cells to treat liver failure ”，發(fā)表在GUT上。本研究將人化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hCiPSCs)作為強(qiáng)大且無基因組整合風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞來源，用于制備高活性和功能性的肝細(xì)胞類器官(hCiPSC-HOs)。采用透氧微孔裝置增加氧氣供應(yīng)，確保細(xì)胞高存活率，并促進(jìn)hCiPSC-HOs 成熟。為維持hCiPSC-HOs 的長期生物功能，運(yùn)用球體的生物打印技術(shù)構(gòu)建肝組織模型(3DP-HOs)，這種方法還顯著降低了肝損傷、炎癥和纖維化指標(biāo)，同時(shí)促進(jìn)了肝臟再生和生物功能表達(dá)。

一、背景介紹

肝移植雖是終末期肝衰竭的金標(biāo)準(zhǔn)，但供體短缺促使探索替代療法�，F(xiàn)有組織工程策略(如微囊化、細(xì)胞片)難以模擬肝微環(huán)境且力學(xué)強(qiáng)度不足，限制長期療效。3D生物打印通過精準(zhǔn)排布細(xì)胞與生物材料，為構(gòu)建可移植肝組織提供新思路。然而，現(xiàn)有研究多采用肝癌細(xì)胞系(如HepG2、HepaRG)，其肝特異性功能不足限制了生物打印肝臟組織的功能，且單細(xì)胞打印細(xì)胞數(shù)量有限，細(xì)胞互作缺失導(dǎo)致功能衰退。

本研究提出創(chuàng)新策略：結(jié)合化學(xué)重編程來源的無基因修飾人多能干細(xì)胞(hCiPSCs)與球體生物打印技術(shù)。通過PDMS基透氣微孔裝置規(guī)模化培養(yǎng)高活性肝類器官(hCiPSC-HOs)，并基于球體打印構(gòu)建高密度肝組織模型(3DP-HOs)。相較于單細(xì)胞打印，球體打印保留類器官內(nèi)細(xì)胞互作，顯著提升肝功能基因(如ALB、CYP3A4)表達(dá)，其功能接近原代肝細(xì)胞(PHHs)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，3DP-HOs在小鼠肝衰竭模型中顯著提高生存率，促進(jìn)肝再生并緩解纖維化，且通過宿主血管網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)長效氧供與代謝支持。該技術(shù)為肝再生醫(yī)學(xué)提供了兼具功能性與穩(wěn)定性的新型治療策略。

圖 1. 研究的細(xì)胞分化過程，實(shí)驗(yàn)途徑和核心創(chuàng)新點(diǎn)

二、結(jié)果

2.1 利用透氧微孔裝置制備高功能 hCiPSC-HOs

本研究基于透氧微孔裝置實(shí)現(xiàn)功能性肝類器官(hCiPSC-HOs)的規(guī)�；�制備。hCiPSC-HPCs(96% CK19/AFP雙陽性)經(jīng)微孔培養(yǎng)自組裝為球體，其直徑(約95 μm)與細(xì)胞活性(>90%，前6天)顯著優(yōu)于傳統(tǒng)2D培養(yǎng)。功能分析顯示，3D球體的白蛋白分泌(峰值9.68±0.65 μg/百萬細(xì)胞/24 h)及尿素合成(214.40 ± 31.60 μg/百萬細(xì)胞/24 h)于第7天達(dá)峰，功能指標(biāo)接近原代人肝細(xì)胞(PHHs)�；�因表達(dá)(HNF4A、CYP3A4等)與功能實(shí)驗(yàn)(ICG代謝、脂質(zhì)代謝等)證實(shí)hCiPSC-HOs具備成熟肝細(xì)胞特性，并形成膽管樣極性結(jié)構(gòu)。該技術(shù)為構(gòu)建生物打印肝模型提供了高活性功能單元。

圖2. 利用透氧微孔裝置規(guī)模化制備高功能 hCiPSC-HOs

2.2 基于球體的肝組織模型的生物打印確保高HCIPSC-HOs生存能力和生物功能

將hCiPSC-HOs與10% GelMA混合制備生物墨水，優(yōu)化顯示細(xì)胞密度為1.5×10⁷ cells/mL時(shí)可維持最佳活性。流變學(xué)分析表明，10% GelMA具有適宜剪切模量(溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度23.5℃)及剪切稀化、自修復(fù)特性，可保護(hù)細(xì)胞免受剪切力損傷。生物打印后，hCiPSC-HOs均勻分布于水凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)(圖3A)，6天內(nèi)保持球體形態(tài)并恢復(fù)活性(第0天76.12%±3.29%，第6天>90%)(圖3B-E)。相比非打印模型，3D打印結(jié)構(gòu)的微通道顯著增強(qiáng)氧擴(kuò)散(HIF-1α/BNIP3低表達(dá))與營養(yǎng)運(yùn)輸，減少中心細(xì)胞死亡。

單細(xì)胞生物打印(使用hCiPSC-Heps)第0天存活率僅52.56% ± 6.37%，且后續(xù)無球體形成，細(xì)胞密度持續(xù)下降。而球體法第6天完全恢復(fù)活性，細(xì)胞密度從12.64 ± 0.49×10⁷ cells/mL增至14.30 ± 1.77×10⁷ cells/mL(圖3F-G)。功能方面，3DP-HOs的ALB分泌(7.77 ± 0.90 μg/百萬細(xì)胞/24 h)與尿素合成(154.21 ±12.20 μg/百萬細(xì)胞/24 h)在第2天最多，基因表達(dá)(HNF4A、CYP3A4等)顯著優(yōu)于hCiPSC-Heps，且CYP3A4活性與未打印球體相當(dāng)(圖3H-J)。免疫熒光證實(shí)3DP-HOs高表達(dá)HNF4A、ALB等關(guān)鍵肝標(biāo)志物(圖3K)�？梢�，球體生物打印技術(shù)成功構(gòu)建高活性、功能成熟的3DP-HOs，為肝衰竭治療提供高潛力移植模型。

三、討論

本研究采用基于hCiPSCs的肝類器官(hCiPSC-HOs)結(jié)合球體生物打印技術(shù)構(gòu)建功能性肝組織模型(3DP-HOs)。通過PDMS基透氣微孔裝置增強(qiáng)氧供，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高活性hCiPSC-HOs制備。與傳統(tǒng)方法(如直接肝細(xì)胞移植易引發(fā)免疫排斥，微囊化移植受限于氧擴(kuò)散不足)相比，3DP-HOs利用GelMA水凝膠構(gòu)建網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，其互連微通道促進(jìn)氧/營養(yǎng)傳輸，顯著提高細(xì)胞存活率，且植入60天后仍保持完整結(jié)構(gòu)(圖7A)，可安全取出。RNA測序顯示，3DP-HOs在打印前后基因表達(dá)譜高度一致(圖4A-B)，雖較原代肝細(xì)胞(PHHs)存在藥物代謝(如細(xì)胞色素P450活性)及免疫功能差距，但其成熟度顯著優(yōu)于hCiPSC-Heps(圖4).........

四、結(jié)論

3DP-HOS與使用基于單核的生物打印制造的模型相比，顯示出增強(qiáng)的細(xì)胞活力，并表現(xiàn)出與HCIPSC-HOS相似的基因剖面，同時(shí)保持乳膠特異性功能。此外，3DP-HOS植入可顯著提高CCL4誘導(dǎo)的急性智力肝衰竭的小鼠的存活率，以及肝衰竭的Fah−/− 小鼠。 3DP-HOS顯著降低了肝損傷，炎癥和纖維化指數(shù)，同時(shí)促進(jìn)肝臟再生和生物功能表達(dá)。我們的生物打印肝組織模型對肝衰竭具有顯著的治療功效，并具有在肝臟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行臨床研究的巨大潛力。

參考文獻(xiàn)

Guangya Li , Jianyu He, Jihang Shi, Xinyi Li, LuluLiu, Xinlan Ge,Wenhan Chen, Jun Jia, Jinlin Wang,Ming Yin,Yasuyuki Sakai,WeiSun,Hongkui Deng, Yuan Pang，Bioprinting functional hepatocyte organoids derivedfrom human chemically induced pluripotent stem cells to treatliver failure,Gut, March 2025. doi: 10.1136/gutjnl-2024-333885