手術中生物打�。菏中g環(huán)境下的組織與器官修復

來源：EngineeringForLife  

術中直接3D生物打印技術（下文簡稱“術中打印”）可以通過快速獲取受損部位的信息，在活體上進行生物打印修復受損組織器官，是一種高效的生物打印策略。對于需要進行組織切除、創(chuàng)傷重建或骨折修復的患者，術中進行受損部位的掃描和生物打印對于提高修復的準確性和效率具有很大的潛力。近期，哈爾濱工業(yè)大學（深圳）的吳洋教授連同美國賓夕法尼亞州立大學的Ibrahim T. Ozbolat教授與DinoJ. Ravnic教授在Trends in Biotechnology雜志上發(fā)表了題為“Intraoperative Bioprinting: Repairing Tissues and Organs in a Surgical Setting”的觀點性綜述文章，從工程和臨床的角度為讀者介紹當前術中打印的主要局限，以及未來其從實驗室到臨床轉(zhuǎn)化的潛力，并著重展開介紹血管化組織和復合組織的術中打印。

一、從體外生物打印到術中打印
在過去的十年中，生物打印技術取得了長足的進步，并在不同組織工程領域得到應用，如組織再生、血管形成、藥物篩選和疾病建模等。然而，大多數(shù)生物打印工作是在體外進行，需要在體內(nèi)進一步驗證。雖然器官直接打印入人體仍十分困難，但科研人員已做出了一些嘗試。 術中打印，也稱為原位打印或體內(nèi)生物打印，是指在手術中對活體進行生物打印的技術，包括缺損部位成像、數(shù)據(jù)處理、工藝路徑規(guī)劃和生物打印等在整個手術過程中的有序進行。組織替代物的術中打印得益于其可以在解剖學上準確地重現(xiàn)復雜組織的異質(zhì)性。盡管術中打印尚未臨床化，但在生物打印技術的快速發(fā)展以及不同領域研究人員的共同努力下，該領域正在穩(wěn)步地發(fā)展。

術中打印有諸多優(yōu)勢。首先，基于水凝膠或細胞聚集體的組織替代物由于其富水特性，初始機械性能通常較弱，使得其在手術操作過程中容易被破壞甚至解體。相反，借助逆向工程方法實現(xiàn)植入體的實時設計，術中打印可以最大限度地降低缺損修復中的污染、結(jié)構(gòu)體崩解和手動干預帶來的風險。更重要的是，術中打印可以應對臨床上由于清創(chuàng)或組織切除而產(chǎn)生的具有不規(guī)則平面的組織缺損。相比之下，體外生物打印通常假設工作表面平整，與臨床情況不符。此外，由于術中打印修復的結(jié)構(gòu)被天然組織包裹，內(nèi)源性細胞通過生物化學與物理方式的誘導，可以遷移到打印的結(jié)構(gòu)中，并分化成具有靶組織特異性的譜系。另外，與手動注射生物材料進入缺損部位相比，術中打印可以精確地沉積細胞、基因或細胞因子，實現(xiàn)局部結(jié)構(gòu)的精確控制與解剖學仿生。對于異質(zhì)細胞形成的組織及區(qū)域分層排列的細胞外基質(zhì)，術中打印具備精確重構(gòu)多層結(jié)構(gòu)的能力，這是使用手動方式難以實現(xiàn)的。最后，水凝膠的形狀變形（例如皮膚再生過程中膠原蛋白的收縮）也是生物打印結(jié)構(gòu)在體外成熟過程中面臨的問題。此外，細胞在體外培養(yǎng)過程中會重塑基質(zhì)，并最終改變甚至破壞預先設計的形態(tài)。因此，術中打印的優(yōu)勢也體現(xiàn)在體內(nèi)整合過程中再生組織可能占據(jù)由于打印結(jié)構(gòu)收縮產(chǎn)生的空隙，并調(diào)節(jié)基質(zhì)的重塑。

二、術中打印的最新進展
盡管術中打印的概念在2007年就首次被提出，但由于在活體上進行生物打印難以實現(xiàn)，后續(xù)較少有相關的研究報道。相對于植入預先制備的結(jié)構(gòu)體，術中打印對生物墨水的制備、生物打印設備、滅菌和手術操作提出了更高的要求。到目前為止，研究人員已運用術中打印針對軟骨、骨骼和皮膚的修復進行了一些嘗試。例如，手持式生物墨水擠出設備已被分別用于羊的軟骨修復模型（圖1A）和豬與鼠的皮膚修復模型。盡管材料沉積過程是手動進行的，但手持設備提出了一套完善的策略以減少水凝膠交聯(lián)所需的外部設備。在骨骼修復方面，Keriquel課題組使用自主開發(fā)的激光生物打印系統(tǒng)在小鼠顱骨缺損模型中進行術中打�。▓D1B）。在他們的后續(xù)研究中，術中打印產(chǎn)生了組織化的微血管網(wǎng)絡和顱骨缺損的骨再生。目前，由于皮膚的易接觸性與強大的再生能力，術中打印最成功的案例大多與皮膚修復相關。近來，Albanna課題組開發(fā)了一款集成了生物成像技術的移動式皮膚生物打印系統(tǒng)，并對小鼠和豬的全層皮膚傷口模型進行了修復（圖1C）。下文將重點介紹目前術中打印在工程和臨床方面的主要局限，并突出闡述其在血管化組織和復合組織重建中的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

圖1 各種術中打印技術在不同組織修復中的應用

三、術中打印的關注點與未來展望
1. 當前生物打印方式的局限性
生物打印按技術主要可分為擠出式、液滴式與激光式。將現(xiàn)有的技術直接應用于術中打印會面臨諸多挑戰(zhàn)。擠出式的生物打印可被認為最適用于術中打印。手動注射（擠出）生物材料已在臨床上應用了數(shù)十年，擠出式打印頭可以被方便地配置在當前應用于泌尿外科和婦科的手術機器人上，實現(xiàn)術中打印。然而，由于擠出式打印頭多為接觸式，打印頭可能會干擾缺損部位周邊的正常組織。對于液滴式打印技術，盡管其分辨率優(yōu)于擠出式，但生物墨水在針頭小孔處的沉淀會提高噴嘴堵塞的風險，增加手術時間并引發(fā)其他并發(fā)癥。受限于打印結(jié)構(gòu)較弱的機械性能，液滴式技術更適合打印厚度較薄的組織，例如皮膚。激光式打印技術具有與液滴式相似的優(yōu)勢（如：高分辨率）和劣勢 （如：打印結(jié)構(gòu)的機械強度低）。由于其組成部件的復雜性（如：激光源和光學組件），激光式打印設備的小型化也是一項挑戰(zhàn)， 復雜的組件限制了體內(nèi)深層組織打印的可能性。

2. 生物墨水與手術環(huán)境的兼容性
由于術中打印的材料沉積是直接在生理條件下進行的，因此，理想的生物墨水不僅應滿足一般生物墨水要求，而且還應具備一些特定屬性，包括1）與所用打印技術兼容并可進行術中打印，以縮短手術時間，2）可快速地在生理溫度與濕度條件下進行原位交聯(lián)，以保留打印結(jié)構(gòu)的完整性和分辨率，3）可商業(yè)化與平價化，以降低手術成本。因此，大多數(shù)常用的需要揮發(fā)性有機溶劑溶解或高溫熔融的生物材料（如：聚己內(nèi)酯，聚乳酸等）不適用于術中打印。在水凝膠中，盡管膠原蛋白在37°C可轉(zhuǎn)變?yōu)槟�膠狀態(tài)，但其緩慢的凝膠化阻礙了其在術中打印中的使用；然而，納米羥基磷灰石增強的膠原蛋白在骨組織的術中打印中表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。由于纖維蛋白原可與凝血酶輪流打印實現(xiàn)快速交聯(lián)，其在術中打印中也很受歡迎。光交聯(lián)生物油墨，例如明膠甲基丙烯酰胺（GelMA）、透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯（HAMA）和聚乙二醇也常用于生物打印。由于將生命體直接暴露在紫外線中可能損傷組織，一種可行方案是將紫外線射向透明打印頭的側(cè)面，在生物墨水擠出過程中實現(xiàn)交聯(lián)固化。近來，由于可見光光引發(fā)系統(tǒng)能避免使用紫外線交聯(lián)破壞細胞活性，其應用也開始普及。除現(xiàn)有的生物墨水外，更多適用于術中打印的材料應被開發(fā)來為術中打印提供更多選擇。新材料應能在無支撐結(jié)構(gòu)的情況下保留生物打印結(jié)構(gòu)的完整性。

3. 術中打印過程的自動化
由于傷口的長時間暴露會增加手術并發(fā)癥的風險，因此，缺損部位的成像應在組織切除后的數(shù)分鐘內(nèi)完成。為了滿足此要求，基于3D攝影測量的掃描技術為獲取缺損部位的形貌數(shù)據(jù)技術提供了最優(yōu)解決方案。此類掃描儀能夠達到高達30 μm的分辨率，掃描時間短，且具有便攜性等優(yōu)勢。此外，圖像處理在創(chuàng)建組織模型時也必不可少，包括圖像預處理、分割、特征提取和數(shù)據(jù)挖掘等。術中打印式，上述所有過程應在獲取掃描數(shù)據(jù)后的幾分鐘內(nèi)完成。因此，優(yōu)秀的圖像分割軟件對于方便地提取感興趣區(qū)域的3D圖像信息至關重要。由于不同的缺損組織具有其獨特的紋理特征，不當?shù)膱D象后處理可能會生成無意義的3D模型，因此，需要對模型進行仔細評估。人工智能和機器人技術可以協(xié)助減少圖象處理時間和操作員造成的誤差。迄今，研究人員一直致力于優(yōu)化術中打印的路徑規(guī)劃，例如使用運動跟蹤在自由移動的手部解剖結(jié)構(gòu)上進行打印。將來，機器學習也可用于自動產(chǎn)生最佳的生物打印策略。

由于水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化和手術中活體運動（如：呼吸）引起的形狀變形， 實現(xiàn)術中打印的自動化、保證打印精度具有很大的挑戰(zhàn)性。此難題有望通過實時監(jiān)控技術觀察打印結(jié)構(gòu)的形變，為后續(xù)材料沉積提供反饋信號來解決。當前已商品化的三軸生物打印設備不足以應對具有不規(guī)則形狀的缺損組織的術中打印，需要使用具有更高自由度的平臺，多自由度的機械臂（如：手術機器人）可能是理想的解決方案（圖2A）。

4. 術中打印組織的血管化
血管化對于生物打印結(jié)構(gòu)的成熟至關重要，尤其是節(jié)段性缺損。驅(qū)使術中打印組織的微血管化有多種方式，例如生物打印內(nèi)皮祖細胞、缺氧誘導因子或血管內(nèi)皮生長因子等。由于新血管生成通常需要10天以上才能開始發(fā)生，一些暫時性策略可以用來延長氧氣供應。 例如，在生物墨水中參入富氧微粒或制氧生物材料，此類生物墨水旨在為細胞提供營養(yǎng)直到毛細血管可以傳輸血液。多孔內(nèi)部結(jié)構(gòu)的引入是生物打印的優(yōu)勢，同時也為促進血液從宿主組織滲透到打印結(jié)構(gòu)體提供了另一種選擇。

術中打印的最終目標是創(chuàng)建一個連接動脈和靜脈、包含嵌入式微脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)體。隨著超顯微外科技術的發(fā)展，現(xiàn)在直接吻合內(nèi)徑小于150μm的微血管已經(jīng)變得可行。該技術進步使得植入體無需暴露于主血管樹便可快速實現(xiàn)血液流動。為了促進植入體的吻合和血管形成，手術中也可以利用各種自體導管創(chuàng)建動靜脈循環(huán)。

圖2 術中打印修復血管化復合組織的示意圖

5. 復合組織的術中打印及其臨床轉(zhuǎn)化
當前，具有多個組成部分的組織的無縫重建仍存在局限，例如：顱頜面缺損（皮膚，骨骼和肌肉），骨軟骨缺損（軟骨和骨骼）以及肌肉骨骼缺損（骨骼，肌肉，肌腱和皮膚）。不同組織類型在生理學、解剖學和組織學方面存在差異，因此，不同組織層的精確打印至關重要。由于將不同部位的干細胞分化為多個譜系能夠模仿天然組織的解剖結(jié)構(gòu)，術中打印需要精確而高效地沉積干細胞和分化因子。以肌骨骼為例，它由內(nèi)而外包括骨骼、血管、肌肉、皮下脂肪和皮膚組織，包含10種以上細胞類型 （圖2B）。

復合組織的術中打印應以最少的手動干預快速獲取缺損部位信息 ，保證解剖學上的準確性。雖然結(jié)構(gòu)體打印時通常按照天然組織的層次結(jié)構(gòu)進行設計，然而，打印組織在成熟過程中可能會改變其結(jié)構(gòu)和表型，從而與天然組織產(chǎn)生差異。由于復合組織通常厚度較大，因此血管形成對于促進組織再生特別重要；血管化不足將導致壞死的疤痕組織占據(jù)缺損部位。目前，皮瓣外科手術是修復復合節(jié)段性缺損的標準。皮瓣是一種自體組織移植物，其中供體組織連同其血管蒂（動脈和靜脈）被整體轉(zhuǎn)移到受體部位。這種技術徹底改變了大型創(chuàng)傷和腫瘤缺陷的治療方法。但是，皮瓣有限的供體數(shù)量和供體部位發(fā)病率限制了其應用。因此，最好的方案是將該手術原理和術中打印技術相結(jié)合。外科醫(yī)生可以通過直接血管吻合或誘導血管生成的方式將受體血液灌注至鄰近的打印結(jié)構(gòu)體中。兩者的結(jié)合將會消除關于供體數(shù)量和發(fā)病率的擔憂，同時提供精確匹配的替換組織。未來，生物打印的組織工程化植入物或可代替自體皮瓣。

術中打印的另一個關注點是天然組織與打印組織，特別是無血管組織的融合（如：軟骨修復）。由于骨骼先天具有較強的修復能力，軟骨在垂直方向上可以與下層骨整合。術中打印具有骨軟骨界面的復合組織也是提高軟骨愈合能力的一個有效的解決方案，可以被應用到全厚度骨軟骨的缺損修復中。然而，打印軟骨與天然軟骨的橫向連接將是實現(xiàn)永久性軟骨置換的主要障礙。增強軟骨橫向整合的策略包括生物墨水的功能化，使之能直接粘合到到相鄰的天然軟骨上。
此外，目前術中打印用到的動物模型很少是承重型組織，例如皮膚和顱骨缺損。未來，將術中打印用于修復承重型缺損模型，如長骨的節(jié)段性缺損和關節(jié)缺損，將獲得更多關注。術中打印結(jié)構(gòu)體的機械強度取決于生物墨水的固有特性，可以通過開發(fā)新材料來提高結(jié)構(gòu)體的機械強度。在這方面，可設想將柔性生物墨水與熱塑性生物材料（如：聚己內(nèi)酯或聚乳酸-乙醇酸共聚物）相結(jié)合，開發(fā)一種便于熱塑性材料快速、安全冷卻的打印技術（如：基于激光的冷卻系統(tǒng)）。另外，常規(guī)的術后護理和康復仍然必不可少，直到打印的組織獲得足夠的機械強度。

四、結(jié)語
術中打印已在組織再生的應用中，包括軟骨，皮膚和骨骼等，顯示了其潛力。然而，復合組織包含軟、硬組織以及之間的界面組織，其再生修復有賴于具有快速穩(wěn)定的交聯(lián)性能的生物墨水以及先進生物打印技術的開發(fā)。此外，尋求一種切實可行的方法來促進血管生成對于組織長期的功能化至關重要。將生物打印與血管吻合術相結(jié)合，代替目前流行的皮瓣手術，顯得十分具有吸引力。從長遠來看，術中打印的自動化不僅是打印流程的簡單集成，同時也需要大量臨床案例來優(yōu)化生物打印的策略。除了科學方面的考量，術中打印的臨床研究也將面臨倫理與監(jiān)管的考驗，共享病人信息用于數(shù)據(jù)庫的建立將引發(fā)私人信息與知識產(chǎn)權保護方面的挑戰(zhàn)。盡管面臨諸多問題，作者仍堅信術中打印將在組織器官修復再生領域產(chǎn)生巨大作用。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2020.01.004