膠原蛋白的快速凝膠化！可用于組織工程與生物3D打印

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在再生醫(yī)學(xué)中，工程化功能性細(xì)胞組織組件極具前景。Ⅰ型膠原蛋白作為人體組織中的關(guān)鍵支架材料，在體外以生物相容的方式控制其組裝動(dòng)力學(xué)存在挑戰(zhàn)，限制了它作為細(xì)胞生物制造中的主要支架或粘合劑的應(yīng)用。標(biāo)準(zhǔn)的Ⅰ型膠原蛋白在中性pH條件下的凝膠化在長度尺度和幾何形狀上的通用性和可調(diào)性有限，其自組裝難以在空間和時(shí)間上精確控制，且典型工作濃度的膠原蛋白溶液流動(dòng)性高，完全凝膠化通常需要數(shù)十分鐘，這給需要快速組裝或準(zhǔn)確定位可溶性膠原蛋白的應(yīng)用帶來了障礙。盡管已有一些技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠原蛋白制造的控制，如紡絲、拉伸、模塑和生物打印等，但這些技術(shù)存在一定局限性，如缺乏復(fù)雜性、受模板限制、化學(xué)修飾影響生理相關(guān)性等，目前在可擴(kuò)展生產(chǎn)具有高可調(diào)性、精度和靈活性的負(fù)載細(xì)胞的膠原蛋白組織以滿足組織工程的多樣化需求方面存在強(qiáng)烈限制。

來自美國耶魯大學(xué)的Michael Mak教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種稱為可調(diào)快速組裝膠原元件（TRACE）的膠原蛋白制造方法，利用大分子擁擠（MMC）實(shí)現(xiàn)未修飾膠原蛋白的即時(shí)組裝。該方法通過應(yīng)用惰性擁擠劑加速膠原蛋白的液-凝膠轉(zhuǎn)變，能夠高通量創(chuàng)建從微米到宏觀長度尺度的生理性膠原蛋白構(gòu)建體，并通過生成可調(diào)的多尺度結(jié)構(gòu)線索促進(jìn)細(xì)胞自組裝和形態(tài)發(fā)生。同時(shí)，該方法在廣泛的濃度范圍內(nèi)提供了一種通用的膠原蛋白生物打印方法，能夠使用pH中性、具有生物活性的膠原蛋白生物墨水直接打印細(xì)胞組織，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和生物功能性。相關(guān)工作以《Instant assembly of collagen for tissue engineering and bioprinting》為題發(fā)表在《Nature Materials》上。本文共同第一作者為中國青年學(xué)者Xiangyu Gong, Zhang Wen和Zixie Liang。

研究內(nèi)容
1. 基于 MMC 的膠原蛋白即時(shí)組裝
通過添加 200 mg/mL 的聚乙二醇（PEG8000）作為擁擠劑，中性膠原液滴在 PEG 浴中1 秒內(nèi)快速凝膠化形成邊界清晰的圓盤，剪切模量驟增表明凝膠強(qiáng)度高。掃描電鏡（SEM）顯示，擁擠環(huán)境促使膠原纖維在界面處快速組裝成薄而致密的纖維網(wǎng)絡(luò)（傳統(tǒng)方法纖維更松散）。

圖 1 MMC誘導(dǎo)的即時(shí)凝膠化促進(jìn)了快速、多尺度的膠原蛋白制造。

2. 高通量微升級(jí)膠原凝膠與微米級(jí)膠原束
微凝膠制備：通過調(diào)節(jié)液滴體積（1-50 μL）可線性控制膠原圓盤面積，覆蓋 2-10 mg/mL 濃度范圍，甚至酸性膠原也能快速凝膠。細(xì)胞負(fù)載凝膠可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

微米束制備：通過移液混合膠原與 PEG 浴，利用剪切流誘導(dǎo)膠原形成定向排列的微米級(jí)纖維束，其厚度和密度可通過膠原濃度調(diào)控（2-9.5 mg/mL），并用于構(gòu)建纖維化肝腫瘤模型。

3. 宏觀膠原構(gòu)建體與生物打印
宏觀條帶制備：利用 PDMS 多通道裝置，在 PEG 浴中快速擠出膠原條帶，細(xì)胞分布均勻且存活良好，可用于構(gòu)建肝組織模型。

自由形式生物打�。涸诤� PEG 的瓊脂糖顆粒支持浴中，實(shí)現(xiàn)低濃度膠原（2 mg/mL）的高精度打印，如 “Yale” 標(biāo)志、心臟瓣膜等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，避免墨水?dāng)U散并提升結(jié)構(gòu)保真度。

4. 血管工程與腸管組織構(gòu)建
血管生成：厚膠原束（9.5 mg/mL）因高孔隙率促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞浸潤和血管網(wǎng)絡(luò)形成，在 VEGF 刺激下生成連通的管腔結(jié)構(gòu)，而薄束（2 mg/mL）因過度壓縮效果較差。

腸管分化：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hPSCs）負(fù)載的膠原條帶經(jīng)定向分化，形成具有隱窩樣芽和中央管腔的腸管結(jié)構(gòu)，表達(dá) SOX17、CDX2 等標(biāo)志物，可維持成熟長達(dá) 5 周。

圖 2：內(nèi)皮細(xì)胞與膠原束自組裝形成血管網(wǎng)絡(luò)及 sprouting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖 3：hPSC 衍生腸管的形態(tài)變化與免疫染色驗(yàn)證。

5. 超細(xì)絲打印與功能性細(xì)胞組織打印
超細(xì)絲制備：利用 20 μm 噴嘴和高濃度 PEG（800 mg/mL），以 10,000 mm/min 高速打印出 5-10 μm 寬的連續(xù)膠原絲，甚至可達(dá) 2.5 μm 分辨率。
功能性組織打印：負(fù)載心肌細(xì)胞的膠原墨水可打印收縮性心室模型，表現(xiàn)出自發(fā)鈣瞬變和藥物響應(yīng)，雙心室結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)同步收縮，泵血功能維持 77 天。

圖 4：超細(xì)絲打印流程、速度與纖維寬度關(guān)系。

圖 5：心肌細(xì)胞打印構(gòu)建體的鈣瞬變檢測(cè)與泵血功能驗(yàn)證。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)的TRACE方法利用大分子擁擠效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了未修飾膠原蛋白的即時(shí)組裝，能在廣泛濃度范圍內(nèi)高通量創(chuàng)建從微米到宏觀尺度的生理性膠原構(gòu)建體。該方法通過調(diào)控多尺度結(jié)構(gòu)線索促進(jìn)細(xì)胞自組裝與形態(tài)發(fā)生，且無需化學(xué)修飾或高濃度酸性條件，生物相容性高�；�于此的生物打印技術(shù)可直接打印含活細(xì)胞的膠原生物墨水，構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和生物功能性的組織，如可收縮的心臟腔室、血管化組織及腸管等。研究拓展了未修飾膠原蛋白在多器官系統(tǒng)組織的可控多尺度生物制造范圍，為再生醫(yī)學(xué)中功能性細(xì)胞組織的工程化提供了新策略，相關(guān)成果為復(fù)雜組織的構(gòu)建和器官再生研究奠定了基礎(chǔ)。

文章來源：https://doi.org/10.1038/s41563-025-02241-7