華中科技大學(xué)材料學(xué)院張祥林、吳斌課題組關(guān)于冷凍3D打印系列研究

來源: EngineeringForLife

冷凍3D打印/低溫沉積制造是將低溫場引入傳統(tǒng)的擠出沉積成型、靜電紡絲等3D打印技術(shù)形成的一種新型3D打印方法。低溫可以使打印漿料在三維支架成型的過程中發(fā)生相分離，原本均勻漿料中的溶劑會結(jié)晶析出；在后續(xù)的處理過程中將溶劑結(jié)晶升華可留下微米級孔洞。如此，可制備具有大孔（100 μm級別）和微孔（1 μm級別）的多級孔三維支架，其多級孔結(jié)構(gòu)能模擬天然組織的結(jié)構(gòu)形貌、提供供養(yǎng)通道、增加載藥能力和礦化面積等，使得多級孔支架相較于單級孔支架有更多優(yōu)勢。而且低溫沉積制造技術(shù)可用的生物材料范圍廣泛，低溫場對生長因子和細(xì)胞較為友好，這些優(yōu)點使得低溫沉積制造技術(shù)在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域很有應(yīng)用前景。

華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的張祥林、吳斌課題組自2019年至今針對冷凍3D打印/低溫沉積制造進行了系列研究，與華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院合作，在Chemical Engineering Journal (2), Bioactive Materials (1), Biofabrication (2) 和Materials & Design (2)等期刊上共發(fā)表了7篇文章，簡介如下：

1. 冷凍靜電紡絲方法制備的用于胃腸道黏膜修復(fù)的仿生雙面膜

大面積的胃腸道黏膜缺損難以修復(fù)，致死率高。現(xiàn)有的人工黏膜制備研究忽視了天然黏膜的褶皺結(jié)構(gòu)與上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的旁分泌作用這兩個特征，導(dǎo)致黏膜修復(fù)不充分。受天然黏膜解剖結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，本文通過冷凍靜電紡絲技術(shù)制備了一種具有仿生結(jié)構(gòu)的雙面電紡膜。首先，冷凍電紡膜的結(jié)構(gòu)與天然消化道黏膜類似，外表面具有褶皺結(jié)構(gòu)，內(nèi)表面平整。褶皺結(jié)構(gòu)和冷凍電紡絲上的微米孔促進了上皮細(xì)胞的增殖。其次，本研究在雙面膜的外表面和內(nèi)表面上分別培養(yǎng)了上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以模擬天然消化道黏膜層的細(xì)胞組成。雙面膜在隔離這兩種細(xì)胞直接接觸的同時，實現(xiàn)了上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞間的旁分泌作用：成纖維細(xì)胞分泌的EGF可以通過雙面膜，刺激另一面的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄更多的c-Myc和Mcl-1，進而在增加上皮細(xì)胞的再生和抗菌能力。總結(jié)，本文提出的冷凍靜電紡絲雙面膜實現(xiàn)了對天然胃腸道黏膜的褶皺結(jié)構(gòu)和旁分泌作用這兩大特點的仿生，為消化道黏膜的大面積缺損提供了一種很有潛力的修復(fù)方案。

圖1 冷凍電紡雙面膜模擬天然消化道黏膜的褶皺結(jié)構(gòu)及旁分泌作用

圖2 a）天然小鼠食道黏膜中的上皮層（E）和固有層（L）的雙層結(jié)構(gòu)

圖3 雙面膜的表面形貌：a）粗糙面；b）平整面

圖4 上皮細(xì)胞細(xì)胞核朝向的分布統(tǒng)計：a）粗糙面；b）平整面

相關(guān)研究成果以“Biomimetic Janus film fabricated via cryogenic electrospinning for gastrointestinal mucosa repair”為題于2023年3月20日發(fā)表在《Materials & Design》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的吳斌博士、講師，和華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科白濤副教授、副主治醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2023.111839

2. 低溫沉積制造的脫細(xì)胞基質(zhì)支架用于雙生長因子次序釋放以促進原位骨再生

原位組織工程是治療骨缺損的一種強有力的策略，它是指不需要在支架上預(yù)負(fù)載細(xì)胞，而是通過支架本身的結(jié)構(gòu)和材料創(chuàng)造一個類似天然骨的微環(huán)境，吸引人體內(nèi)干細(xì)胞歸巢，在支架處原位修復(fù)骨缺損的方法。它可以避免傳統(tǒng)的骨組織工程支架所需的細(xì)胞擴增步驟、低細(xì)胞存活率及免疫排斥風(fēng)險。本文通過低溫沉積制造技術(shù)制備了聚己內(nèi)酯（PCL）/小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（dSIS）雙材料多孔支架，隨后在支架中負(fù)載了兩種活性生長因子（適配體（Apt19s）和PlGF-2123-144*融合的BMP2（pBMP2））進行表面修飾。兩種生物活性分子與支架中dSIS的親和力強弱不同，因此可按次序相繼釋放。首先，適配體Apt19s快速釋放，它對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）表現(xiàn)出結(jié)合親和力，可將干細(xì)胞吸引至支架上，完成歸巢。其次，pBMP2緩慢釋放，可促進已歸巢的干細(xì)胞發(fā)生成骨分化。體外實驗結(jié)果表明低溫沉積制造多孔支架的雙生長因子次序釋放促進了細(xì)胞遷移、增殖、堿性磷酸酶活性，以及成骨相關(guān)基因的mRNA表達。體內(nèi)結(jié)果表明了這一釋放系統(tǒng)顯著增加大鼠顱骨臨界尺寸缺損的骨修復(fù)。因此，本文證明了低溫沉積制造多孔支架作為新型藥物釋放平臺所顯示的實現(xiàn)無細(xì)胞原位骨再生策略的潛力。

圖5 低溫沉積制造的PCL/dSIS支架及其促進原位骨再生的能力

相關(guān)研究成果以“In situ bone regeneration with sequential delivery of aptamer and BMP2 from an ECM-based scaffold fabricated by cryogenic free-form extrusion”為題于2021年4月發(fā)表在《Bioactive Materials》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的吳斌博士、講師，和華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的郭曉東教授、主任醫(yī)師，第一作者為孫亭方博士、主治醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.04.013

3. 低溫沉積制造的載外泌體支架用于糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)

盡管治療策略不斷改進，糖尿病創(chuàng)面的愈合仍然是一個世界級難題，這是由于高血糖導(dǎo)致的血管功能障礙會導(dǎo)致血供不足、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，造成創(chuàng)面久久不愈。本文利用低溫沉積制造技術(shù)制備了豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（dSIS）支架，將其與介孔生物玻璃（MBG）以及外泌體相結(jié)合，構(gòu)建了3D支架敷料（dSIS/MBG@Exos)，使得外泌體的持續(xù)性釋放成為可能。dSIS/MBG@Exos水凝膠支架具有良好的多孔性、生物相容性和止血能力，可促進細(xì)胞增殖、遷移和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的血管生成。體內(nèi)實驗結(jié)果證明dSIS/MBG@Exos水凝膠支架可增加糖尿病創(chuàng)面的血管生成和血流。dSIS/MBG@Exos水凝膠支架還能促進肉芽組織的形成和膠原纖維的沉積，這些因素都有利于促進創(chuàng)面愈合。總之，這項研究提出了有潛力的治療糖尿病創(chuàng)面的新策略。

圖6 低溫沉積制造的載外泌體支架用于糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)

相關(guān)研究成果以“Cryogenic 3D Printed Hydrogel Scaffolds Loading Exosomes Accelerate Diabetic Wound Healing”為題于2021年11月發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上。通訊作者為華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的劉國輝教授、主任醫(yī)師、熊蠡茗教授、主任醫(yī)師和米博斌博士、主治醫(yī)師，第一作者為協(xié)和骨科的胡益強博士、主治醫(yī)師和華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的吳斌博士、講師。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.130634

4. 低溫沉積制造含小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)和Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石的骨組織工程支架

新型的骨生物材料最好能夠模擬天然骨的結(jié)構(gòu)和組成，并具有足夠的生物多功能性以按時間順序促進骨再生。本文通過低溫沉積制造技術(shù)制備了由小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（SIS-ECM）和Sr2+/Fe3+共摻雜的納米羥基磷灰石（SrFeHA）組成的新型仿生支架。這種SIS/SrFeHA支架表現(xiàn)出了理想的互連三維大孔/微孔結(jié)構(gòu)、粗糙微表面和增強的力學(xué)強度，同時具有協(xié)同釋放的生物活性ECM和Sr2+/Fe3+離子。這些良好的物理化學(xué)性質(zhì)使得SIS/SrFeHA復(fù)合支架能產(chǎn)生高度仿生的骨骼微環(huán)境，可通過免疫調(diào)節(jié)來增強血管生成、成骨和生物礦化。體內(nèi)的顱骨缺損和皮下植入實驗的結(jié)果證實了SIS/SrFeHA支架在刺激早期免疫反應(yīng)、新生血管形成和體內(nèi)骨再生等方面的優(yōu)越能力，表明SIS和SrFeHA的混合能加速骨愈合過程。此外，通過RNA測序分析證明了SIS/SrFeHA復(fù)合支架能上調(diào)Amot+/YAP-/Hippo信號通路以促進血管生成。因此，本文表明了SIS/SrFeHA復(fù)合支架誘導(dǎo)骨愈合的潛力，同時更好地闡述了活性SrFeHA成分的潛在機制，從而可能提供了一種新的有前景的未來骨組織工程植入物。

圖7 低溫沉積制造含小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)和Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石的骨組織工程支架

相關(guān)研究成果以“Cryogenically 3D printed biomimetic scaffolds containing decellularized small intestinal submucosa and Sr2+/Fe3+ co-substituted hydroxyapatite for bone tissue engineering”為題于2021年11月發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的張祥林教授，和華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的郭曉東教授、主任醫(yī)師，第一作者為楊亮博士。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.133459

5. 低溫沉積制造的多孔Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石骨組織工程支架

開發(fā)具有生物多功能的多摻雜生物陶瓷對骨組織工程很有吸引力和前景。據(jù)此，本課題組此前已設(shè)計了摻雜濃度固定在10 mol%的系列梯度Sr2+/Fe3+共摻雜納米羥基磷灰石（SrFeHA）。為評估其促進骨愈合的潛力，本文將其與聚已內(nèi)酯（PCL）混合，通過低溫沉積制造技術(shù)制備了新型的梯度SrFeHA/PCL支架。制備的支架展示出了良好的三維互連多孔結(jié)構(gòu)和粗糙微表面，以及具有生物活性的Sr2+/Fe3+。這些有利的物理化學(xué)性質(zhì)使支架實現(xiàn)了體外和體內(nèi)的有效生物應(yīng)用，特別是中度共摻雜的Sr7.5Fe2.5HA支架和Sr5Fe5HA支架表現(xiàn)出了顯著增強的生物活性，不僅直接促進了MC3T3成骨細(xì)胞和HUVECs的功能，而且還可以刺激巨噬細(xì)胞活化，同時促進成骨/血管生成。此外，體內(nèi)皮下植入和顱骨缺損修復(fù)實驗的結(jié)果進一步證實了它們通過釋放Sr2+/Fe3+引發(fā)免疫反應(yīng)、促進植入物血管化和原位骨再生的優(yōu)越能力。綜上，本文展示了Sr7.5Fe2.5HA和Sr5Fe5HA復(fù)合支架通過偶聯(lián)血管生成/成骨和免疫調(diào)節(jié)促進了骨再生進程，因此可能提供了一種新的骨組織工程植入物。

圖8 低溫沉積制造的多孔Sr2+/Fe3+共摻雜羥基磷灰石的骨組織工程支架

相關(guān)研究成果以“Bioactive Sr2+/Fe3+ co-substituted hydroxyapatite in cryogenically 3D printed porous scaffolds for bone tissue engineering”為題于2021年4月發(fā)表在《Biofabrication》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的張祥林教授，和華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的郭曉東教授、主任醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/abcf8d

6. 低溫沉積制造的多孔聚已內(nèi)酯組織工程支架

本文基于低溫沉積制造（-20℃）和后續(xù)的冷凍干燥制備了高孔隙率、高保真度的聚己內(nèi)酯（PCL）支架。冷凍干燥在一定程度上導(dǎo)致支架沿X、Y和Z軸收縮。CP600，CP800和CP1000三種支架的孔隙率分別為64.0±1.2%、70.1±1.3%和74.3±0.6%。本文對低溫沉積制造（ECP）的支架進行了多種結(jié)構(gòu)特征表征，并將之與通過傳統(tǒng)熔融3D打�。‥MP）制備的支架進行了比較。ECP支架中PCL的結(jié)晶度（57.1±2.2%）低于EMP支架（69.8±1.3%）。ECP支架表現(xiàn)出了更高降解性和較低的抗壓性能。此外，ECP支架促進了MCT3T-E1細(xì)胞的黏附和增殖，并使其表現(xiàn)出了良好的舒展形態(tài)�？傊�，本文證明了低溫沉積制造的PCL支架具有潛在的組織工程應(yīng)用。

圖9 低溫沉積制造的多孔聚已內(nèi)酯組織工程支架

相關(guān)研究成果以“Fabrication and characterization of porous polycaprolactone scaffold via extrusion-based cryogenic 3D printing for tissue engineering”為題于2019年6月發(fā)表在《Materials & Design》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的張祥林教授和李文超博士（現(xiàn)為南昌大學(xué)先進制造學(xué)院講師）。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2019.107946

7. 低溫沉積自由成形小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架在皮膚組織工程中的潛在應(yīng)用

本文提出了一種低溫沉積自由成形的3D打印策略，用以打印小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)（dSIS）多孔支架。dSIS的流變性能包括動力粘度、儲能模量（G′）和損耗模量（G〃）等均適用于擠出成型。本文制備了三組不同的支架：P500、P600和P700，它們的絲間距（多孔支架中相鄰兩根纖維間的距離）分別為500、600和700 μm。打印參數(shù)包括：5mm/s的平臺工作速度（Vxy）、25 kPa的擠出壓力（P）和-20 ℃的制造溫度。支架尺寸在制備過程中會發(fā)生變化，因此，本文對冷凍打印支架的初始狀態(tài)、冷凍干燥后的狀態(tài)和使用模擬體液（PBS）清洗后的狀態(tài)進行了比較；并且比較了P500、P600和 P700支架的楊氏模量。細(xì)胞實驗結(jié)果表明，細(xì)胞在支架表面和內(nèi)部生長良好，細(xì)胞的黏附程度、活性和增殖率均得到了增加。此外，體外基因和蛋白質(zhì)表達結(jié)果表明dSIS支架可以促進皮膚成纖維細(xì)胞分泌一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（即I型膠原、III型膠原和纖連蛋白）。綜上，本文提出了一種新策略，通過結(jié)合低溫沉積制造技術(shù)和脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)材料制備了理想的皮膚組織工程支架。


相關(guān)研究成果以“Cryogenic free-form extrusion bioprinting of decellularized small intestinal submucosa for potential applications in skin tissue engineering”為題于2019年5月發(fā)表在《Biofabrication》上。通訊作者為華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院、材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室的張祥林教授，和華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科的熊蠡茗教授、主任醫(yī)師，第一作者為石磊博士和協(xié)和骨科的胡益強博士、主治醫(yī)師。

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab15a9